通用外泌体分离试剂盒（SEC法）

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1. 样品预处理
1） 去除细胞。4℃，300 g，离心5 min，转移上清到新的离心管；
注意：对无细胞的样品，可以跳过此步骤。
2） 去除细胞及细胞碎片。4℃，2000 g，离心10 min，转移上清到新的离心管；
3） 去除大体积颗粒。步骤 2）得到的上清，4℃，14000 g，离心30 min，转移上清到新的离心管。
2. 纯化柱预处理
1） 提前将纯化柱（Exosome Purification Column (30 mL)）安装在纯化柱固定器（Purification Column Stand）上，纯化柱下面放置废液槽。放置于室温30 min以上，恢复室温；
注意：纯化柱需充分平衡至室温（18-25℃），温度过低或过高，都会影响外泌体分离效果。
2） 检查纯化柱下端是否充满液体。如果纯化柱下端无空气，可以跳过该步骤；若纯化柱下端存在空气，将纯化柱倒置，打开下端密封帽，用移液器或注射器取水或20%乙醇顶出空气，在密封帽中充满水或20%乙醇，再盖上密封帽，放回固定器上；
3）先打开纯化柱顶盖，再打开下端的密封帽，弃去纯化柱上的封柱液（可直接倒掉或者用移液器吸取），向纯化柱中加入 6 mL PBS 备用。将适配器（Column Adapter (30 mL)）与纯化柱连接，并从顶部加入加2倍柱体积（60 mL）PBS平衡纯化柱，至下方没有溶液流出。清洗过程中，纯化柱的顶部筛板必须始终保持湿润。冲洗完成后，盖上底端密封帽，断开适配器，加入3 mL PBS备用。
a. 注意要先打开纯化柱上盖，再打开下端的密封帽，否则空气将进入纯化柱中，影响外泌体分离效果。
b. 在整个外泌体分离纯化过程中，纯化柱的顶部筛板必须始终保持湿润，否则影响外泌体分离效果。
c. 需要向纯化柱中加入大体积溶液时，可以将适配器与纯化柱连接，将溶液加入到适配器中。
d. PBS推荐新鲜配制并经0.2 μm滤膜过滤，或采购商业化无菌的PBS，避免微生物或颗粒物污染。PBS溶液使用前，必须平衡到室温，否则纯化柱中可能出现大量气泡，影响外泌体分离效果。
3. 分离外泌体
1） 样品上样。移除纯化柱中的PBS，在上方加入3 mL样本；样本不足3 mL，可用PBS补至3 mL，混匀后上样。取下纯化柱底部密封帽，等待样本全部进入纯化柱内后，再加PBS；
a. 如果样品体积超过3 mL，建议试用50 kDa超滤管浓缩样品至3 mL，注意浓缩体积不超过20倍。超滤浓缩方法详见超滤管的说明书。
b. 对于高粘度样本，如血浆、血清、高粘度胸腹水等样本，可取1.5 mL样本，用PBS稀释至3 mL，混匀后上样。
c. 必须待样品全部进入筛板后，再加入PBS，避免样品被稀释影响分离效果。
2） 外泌体分离。先在纯化柱下方准备好1.5mL离心管，然后在纯化柱上方加入1 mL PBS。待下方收集到1 mL馏分后，可加下一次1 mL PBS，换新的1.5 mL离心管收集。根据流出顺序分别标记馏分管编号。
3） 外泌体收集。收集8、9、10、11、12号馏分管即可获取外泌体，其中9、10、11号馏分管的外泌体浓度更高。收集液可直接测定外泌体颗粒数和蛋白浓度。
4) 外泌体浓缩。测定收集外泌体的颗粒浓度和蛋白浓度，根据后续实验要求，决定是否对外泌体收集液进行浓缩。如浓缩，建议使用MWCO 50 kDa的超滤管，4000 g离心浓缩到目的体积即可。
4. 纯化柱维护
1） 收集完所有馏分后，将适配器与纯化柱连接，并从顶部加入至少2倍柱体积（60 mL）PBS清洗纯化柱，至下方没有溶液流出。
2） 再加1.5倍柱体积（45 mL）的20%乙清洗纯化柱，至下方没有溶液流出。
3） 最后取下适配器，向纯化柱中加入5 mL 20%乙醇的封闭液，安装纯化柱顶盖，然后在密封帽中充满20%乙醇，盖到纯化柱下端出口，置于4℃直立保存。

1. 新购买或使用后的纯化柱，上筛板和白色琼脂糖微球之间可能会出现一定的空隙，这是储存和使用过程中凝胶沉降造成的，并不影响纯化柱的性能，将上筛板向下推至无空隙即可正常使用；
2. 纯化柱保存在封闭液中，封闭液为20%乙醇。20%乙醇建议现配现用，同时经0.2 μm滤膜过滤、超声或真空脱气，避免造成纯化柱出现大量气泡，影响分离效果；
3. 每次纯化柱使用前需要使用无菌并平衡至室温的PBS清洗。PBS建议现配现用，同时经0.2 μm滤膜过滤、超声或真空脱气，避免造成纯化柱出现大量气泡，影响分离效果；
4. 纯化柱中间不能有气泡，使用前后需认真检查，避免影响实验；
5. 纯化柱可以反复利用，但是多次使用会影响效果，建议重复使用不超过5次；
6. 当分离的外泌体进行NGS或者其他组学分析时，为避免交叉污染，建议每个样品使用一支新的纯化柱。