原代细胞的复苏步骤

　　细胞一般储存在液氮中，温度达-196℃，理论上储存时间是无限的。细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。

　　细胞复苏就是要把原本冷冻保存(冻存)着的细胞恢复到一般的生长状态，今天我们来看看原代细胞的复苏步骤。

　　一、检查

　　收到细胞株包裹时，请检查细胞株冷冻管是否有解冻情形，若有请立即处理告诉寄方。细胞株请尽速开始培养，或立即冷冻保存(置于–70 °C，隔夜后，移到液氮罐保存)。

　　二、冷冻细胞解冻　

     方法一：

1、准备好37度水浴锅，预热至37度；

2、准备好T25培养瓶，加入10ml完全培养基（培养基量必须大于冻存液10倍体积）；

3、取出冻存细胞管，用一次性PE手套包裹冻存管（防止管内进水导致污染），迅速放于水浴锅内，于1min内融化完全；

4、取出冻存管，酒精喷洒消毒后擦干，置于超净台内；

5、吸取冻存管内细胞悬液，加入步骤2中准备好的T25培养瓶内，8字缓慢摇匀；

6、培养瓶放于37度CO₂恒温培养箱内，静置培养24h，更换新鲜换培养基（注意贴壁细胞、悬浮细胞不同操作方法）。

     方法二：

1、准备好37度水浴锅，预热至37度；

2、准备好15ml无菌离心管，加入10ml完全培养基（培养基量必须大于冻存液10倍体积）；

3、准备好实验用培养板或培养器皿；

4、取出冻存细胞管，用PE手套包裹冻存管（防止管内进水导致污染），迅速放于水浴锅内，于1min内融化完全；

5、取出冻存管，酒精喷洒消毒后擦干，置于超净台内；

6、吸取冻存管内细胞悬液，加入步骤2中准备好的15ml无菌离心管，轻轻吹打混匀；

7、将离心管内细胞悬液，按实验需求接种于实验器皿内（注意接种密度不低于2×10⁴/cm²），放于37度CO2恒温培养箱内，静置培养24h，更换新鲜换培养基（注意贴壁细胞、悬浮细胞不同操作方法）。　　

　　三、细胞复苏注意事项

1、整个复苏过程要尽量快，溶解时间太长可能影响复苏效果；

2、已溶解的冻存细胞尽量短时间的在常温存放，尽快稀释或者离心去除DMSO；

　　3、由于“化冰”这一步里冻存管与水温差太大，尤其是液氮里拿出来的冻存管，放到水里可能会造成翻江倒海的既视感，所以可以用镊子夹住冻存管往水里摁，这样即使有炸裂的情况也会有水做缓冲；

　　4、取冻存管时要谨防冻伤，尤其是夏天，尽管热也最好穿长袖白大褂；

　　5、离心这一步也可以在冻存管里的冰融化后直接进行，也就是直接把冻存管离心，离心后弃去原来的冻存液，然后直接加完全培养基重悬细胞，接着把细胞转到培养皿/瓶里培养。这种方法也许不能将DMSO清除得很干净，但是基本影响不大；

　　6、 复苏第二天记得去看看细胞，如果状态还不错的话就说明复苏成功。