贴壁细胞的冻存

本视频为普诺赛贴壁细胞冻存操作指南，对每一步操作都做了演示，以便实验者更好地理解贴壁细胞冻存实验过程。

贴壁细胞冻存实验准备：
将15mL离心管、冻存管、PBS缓冲液、移液管、电动移液器等物品提前放入生物安全柜中，紫外照射30min消毒灭菌；
细胞完全培养基、0.25%胰酶-0.02%EDTA、细胞冻存液等从4℃冰箱中取出后，复温至室温，备用；程序降温盒复温至室温备用。

贴壁细胞冻存操作步骤：
1. 从培养箱中取出准备冻存的细胞；
2. 显微镜下观察细胞状态并拍照记录；
3. 酒精消毒培养瓶后放入安全柜中；
4. 吸去多余的培养基，加人2~3ml PBS缓冲液润洗一次；
5. 加入1ml胰酶，放入37℃消化；
6. 消化1min左右，在显微镜下观察细胞消化情况；  
7. 消化完全后，加3ml完全培养基终止；
8. 将细胞悬液移入15ml离心管中离心，1000rpm/min（约200g）离心3-5min；
9. 吸去多余的液体，向细胞沉淀中加入适量的冻存液，轻轻吸打混匀；
10. 按比例分装至冻存管中；
11. 贴好标签后放入梯度冻存盒中；
12. 将冻存盒放入-80℃，降温过夜后，移入液氮中保存。

注意事项：
1）细胞冻存液需提前配制，不可直接将DMSO加入细胞悬液中；
2）不同细胞消化时间有差异，以实际镜检结果为准，大部分细胞回缩变圆并有少量细胞脱落即可中止消化，消化时间不宜过长；
3）应选择汇合度80%-90%左右，细胞处于对数生长期时进行冻存操作，确保细胞冻存时状态最佳，冻存密度可根据细胞特性进行调整；
4）冻存细胞保存温度应低于-130℃，不可在-80℃长期保存。